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雙抗體夾心法檢測抗原實驗步驟
更新時間:2015-11-20   點擊次數(shù):2676次

雙抗體夾心法檢測抗原

    雙抗體夾心法用于檢測抗原。它是利用待測抗原上的兩個抗原決定簇A和B分別與固相載體上的抗體A和酶標記抗體B結(jié)合,形成抗體A-待測抗原-酶標抗體B復(fù)合物,復(fù)合物的形成量與待測抗原含量成正比。

實驗步驟

1.用包被液稀釋包被抗體至合適濃度,包被酶聯(lián)板,每孔100μL。也可37℃,2小時包被,但此方法不建議使用。包被抗體即可以是單抗,也可以是多抗。但抗體的包被濃度應(yīng)當通過預(yù)實驗確定。包被的板條可以在4℃保存數(shù)月。

2.每孔加入100ul洗滌緩沖液,清洗酶聯(lián)板3-5次。

3.10%小牛血清封閉,每孔200μL,濕盒中37℃封閉1小時。也可以用1.5%酪蛋白或者0.25%的BSA封閉。

4.每孔加入100ul洗滌緩沖液,清洗酶聯(lián)板3-5次。zui后一次在吸水紙上扣干。

5.加標準樣品及樣本。

(1)標準曲線:用1×PBS稀釋標準品分別至1000ng/ml、500ng/ml、250 ng/ml、125 ng/ml、62.5 ng/ml、31.25 ng/ml、15.625 ng/ml、7.18 ng/ml。

(2)待測樣品:用1×PBS稀釋(不同樣品的稀釋倍數(shù)不同,一般稀釋原則為稀釋后的樣品濃度應(yīng)在標準曲線之內(nèi))。

(3)以上下做平行孔,前兩孔作空白加入1×PBS,其余依次加入標準曲線、待測樣品。加入體積每孔100ul。濕盒中37℃反應(yīng)1小時。

抗原抗體反應(yīng)比較快,一般1~2小時就達到峰值。延長反應(yīng)時間容易出現(xiàn)非特異結(jié)合。

6.每孔加入100ul洗滌緩沖液,清洗酶聯(lián)板3-5次。zui后一次在吸水紙上扣干。

7.加酶標二抗,根據(jù)抗體使用說明用1×PBS稀釋,每孔100ul濕盒中室溫反應(yīng)40分鐘。

二抗的使用濃度應(yīng)當進行預(yù)實驗確定,二抗的反應(yīng)時間不能過長,容易出現(xiàn)非特異反應(yīng)。

8.每孔加入100ul洗滌緩沖液,清洗酶聯(lián)板3-5次。zui后一次在吸水紙上扣干。

9.加底物顯色液:稱取OPD(鄰苯二胺)4mg用10ml底物緩沖液充分溶解,加入15ul H202每孔100ul閉光反應(yīng)5分鐘。OPD要充分溶解,否則容易出現(xiàn)個別孔顏色太深。

10.終止液終止反應(yīng)每孔100ul終止液。

11.酶聯(lián)免疫檢測儀492nm讀數(shù)。

12.以測定的OD值繪制線性回歸標準曲線,以標準品蛋白濃度LN值為橫坐標,相應(yīng)的OD值為縱坐標,繪制出一條標準曲線并添加線性回歸趨勢線,其相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)大于0.95,根據(jù)方程計算出樣品中的目標蛋白含量。抗體

 

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